Brief introduction of ordinary PCR
20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现。1985年,美国科学家Kary Mullis发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性。尔后,Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高。
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。( DNA高温变性低温复性)
发现耐热DNA聚合同酶#Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。
1、常规PCR结合电泳分析方法的缺点
2、只能对终产物进行分析,无法对起始模版准确定量
3、必须在扩增反映结束后借助电泳方法分析,费时费事
4、无法对扩增反应实时检测
5、EB有毒
定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化,通过仪器软件实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。
荧光探针法和荧光染料法。
→ PCR反应体系中加入荧光染料
→ 所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分(检测器、激发光源、热循环模块)
→ 在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强
→ 每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加
→ PCR软件计算出数据,用于实验结果的分析
→ 苏州旷远产品技术平台:ARMS检测方法;1个SNP位点设计双管反应,含目的基因检测及内参检测双通道。
→准确可靠,临床双盲对照试验>1000例,结果与金标准测序法比对,结果一致性大于99%。
→ 高灵敏:可检测低至10ng的人基因组DNA。
→快速:整个检测流程只需3小时。
→简便:试剂盒提供预混好的试剂,使体系配置操作简便。
→防污染
→高特异性:双重特异性组成,保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对,才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对,在延伸中产生荧光。
方法 |
原理 |
适用 |
优点 |
弱点 |
操作 |
准确性 |
市场应用 |
DNA芯片 |
PCR-芯片杂交 |
多位点 |
多基因,多为点同时 |
少数位点 |
步骤多,易污染 |
较高 |
临床使用 |
PCR-RFLP |
PCR-酶切-电泳 |
SNP位点 |
无 |
多位点 |
步骤多,易污染 |
较高 |
逐步淘汰 |
Sanger测序 |
PCR-测序 |
SNP位点,缺失突变 |
时间长 |
步骤多 |
金标准 |
无注册证 |
|
PCR-荧光染料法 |
荧光PCR |
单个基因 |
快速,简便 |
假阳性 |
简单一步 |
高 |
核酸检测 |
PCR-荧光探针法 |
Taqman |
SNP,多态性 |
快速,简便 |
少数位点 |
简单一步 |
高 |
普及 |
液相芯片法 |
PCR-液相杂交 |
SNP, 多基因,多位点 |
易污染 |
步骤多 |
较高 |
非主流 |